http://hdl.handle.net/20.500.11816/4217 2026-04-14T22:36:43Z 2026-04-14T22:36:43Z Rajão, António Miguel Sousa Mendes http://hdl.handle.net/20.500.11816/4958 2026-02-07T03:00:09Z 2026-01-01T00:00:00Z

Evaluation of the potential of oral bacteria in the prevention and/or treatment of oral candidiasis Rajão, António Miguel Sousa Mendes A candidíase oral (CO) é das infeções mais comuns em doentes imunocomprometidos. Causada sobretudo por C. albicans, mas foi demonstrado que espécies de Candida não albicans podem exacerbar esta condição. Os biofilmes de Candida são estruturas complexas, criando um ambiente hostil ao tratamento, levando à recorrência da C0. A disponibilidade limitada de tratamentos, agrava as infeções e conduz a situações de risco de vida. A CO tornou-se uma questão de saúde pública, terapias alternativas são cruciais para superar o problema. Podendo os probióticos e/ou pós-bióticos ser uma solução eficaz. A Organização Mundial de Saúde, define probióticos como microrganismos vivos que conferem benefícios para a saúde quando administrados em quantidades adequadas. Os probióticos orais têm sido usados no controlo da homeostasia da cavidade oral. Os benefícios incluem regulação da flora residente, inibição da adesão de microrganismos, secreção de moléculas antimicrobianas e modulação do sistema imune. Os lactobacilos estão presentes no ambiente oral como parte do microbioma humano, algumas estirpes mostraram benefícios em problemas orais. O principal objetivo desta investigação foi isolar estirpes de lactobacilos com atividade antifúngica da cavidade oral de indivíduos saudáveis para utilizar no tratamento ou prevenção da CO. Após uma seleção preliminar, foi identificada a L. reuteri AJCR4, uma bactéria oral isolada de indivíduos sem cáries, como que possuí a melhor atividade antifúngica. Quando testada contra células planctónicas de Candida spp. não foram detetadas células viáveis de C. albicans SC5314 ou C. tropicalis ATCC750. Para C. glabrata ATCC2001 e C. parapsilosis ATCC22019, observou-se uma redução de ~4 Log10 e ~2 Log10, respetivamente, com 108 CFU/mL de células bacterianas. A aplicação do sobrenadante livre de células do AJCR4 contra biofilmes de Candida resultou na não deteção de células viáveis para C. albicans SC5314 e C. tropicalis ATCC750. Enquanto, a suspensão celular de AJCR4 (108 CFU/mL) causou uma redução de ~2 Log10 para as mesmas estirpes. Foram observadas reduções nos biofilmes de, C. glabrata ATCC2001 de 3 Log10 e de C. parapsilosis ATCC22019 de > 2 Log10, com a suspensão bacteriana. O sobrenadante causou uma redução de ~3 Log10 para C. parapsilosis ATCC 22019 e ~2 Log10 para C. glabrata ATCC 2001. Em discos de acrílico, o meio sem células de AJCR4 reduziu a adesão de Candida, resultando na não deteção de células viáveis na superfície. Foram aplicados tratamentos (neutralização do pH, calor e enzimas) ao sobrenadante do AJCR4, para indiciar sobre a natureza dos compostos produzidos pela bactéria. Constatou-se que a atividade antifúngica do AJCR4 não pode ser atribuída a apenas uma substância. L. reuteri AJCR4 apresentou, atividade antifúngica notável contra biofilmes de Candida. Este isolado e/ou o seu pós-biótico poderão constituir uma alternativa para a prevenção e/ou tratamento da CO, sobretudo nos casos de infeção recalcitrante.; Oral candidiasis (OC), one of the most common infections in immunocompromised patients. Mainly caused by C. albicans, but non-albicans Candida species have been shown to exacerbate this condition. Candida biofilms are complex structures, creating an environment hostile to treatment, leading to the recurrence of OC. The limited availability of therapeutic alternatives escalates the infections and leads to life-threatening conditions. As OC became a public health concern, alternative therapies are crucial in overcoming the problem. In this context, probiotics and/or postbiotics could be an effective solution. To World Health Organization, probiotics are defined as live microorganisms that confer health benefits when administered in adequate amounts. Oral probiotics have been used to control oral cavity homeostasis. Their benefits include regulating the resident flora, inhibiting the adhesion of microorganisms, secreting antimicrobial molecules and modulating the immune system. Lactobacilli are present in the oral environment as part of the human microbiome, and some strains have been shown to be beneficial, in addressing oral health issues. The main purpose of this research was thus to isolate Lactobacillus strains with anti-Candida activity from the oral cavities of healthy subjects for use in the treatment or prevention of OC. Preliminary screening identified L. reuteri AJCR4, an oral bacterium isolated from caries-free individuals, with the best anti-Candida activity. When tested against the planktonic form of Candida spp., no viable C. albicans SC5314 or C. tropicalis ATCC750 cells were detected. For C. glabrata ATCC2001 and C. parapsilosis ATCC22019, a reduction of ~4 Log10 and ~2 Log10, respectively, was observed with 108 CFU/mL of bacterial cells. The application of AJCR4 cell-free supernatant against Candida biofilms resulted in no viable cells being detected for C. albicans SC5314 and C. tropicalis ATCC750. Meanwhile, the AJCR4 cell suspension (108 CFU/mL) caused a ~2 Log10 reduction for the same strains. With C. glabrata ATCC2001 and C. parapsilosis ATCC22019 biofilms, reductions of 3 Log10 and more than 2 Log10 were noted with the cell suspension, respectively. Using the cell-free supernatant resulted in a reduction of ~3 Log10 for C. parapsilosis ATCC 22019 and ~2 Log10 for C. glabrata ATCC 2001. On acrylic discs, the presence of AJCR4 cell-free medium reduced Candida adhesion, resulting in no viable cell detection on the surface. Treatments (pH neutralization, heat, and enzymes) applied to the AJCR4 cell-free supernatant to gain insight into the types of compounds produced by the bacterium. This established that the antifungal activity of AJCR4 cannot be attributed to one substance alone. Because L. reuteri AJCR4 exhibited notable antifungal activity against Candida biofilms, this oral isolate and/or its postbiotic could be an alternative strategy for preventing and/or treating OC, particularly in cases of recalcitrant infection.

2026-01-01T00:00:00Z Silva, João Pedro Nunes http://hdl.handle.net/20.500.11816/4943 2026-02-05T14:38:34Z 2025-01-01T00:00:00Z

The Second-generation of antimitotics: mechanistic insights into the anticancer activity and therapeutic potential Silva, João Pedro Nunes O cancro da cabeça e do pescoço encontra-se entre os tipos de cancro mais comuns e prevalentes a nível mundial. O cancro da cabeça e do pescoço é constituído por diversos tipos de cancro sendo o cancro oral o mais prevalente e mortal. Embora tenham sido observadas pequenas melhorias na sobrevivência de pacientes com cancro oral, os casos mais avançados da doença continuam a apresentar baixa taxa de sobrevivência. Deste modo, novas abordagens terapêuticas são essenciais para o tratamento desta doença. Os agentes anti-microtúbulos (MTAs) têm sido amplamente usados no tratamento do cancro oral, sobretudo em combinações terapêuticas. Contudo, estes fármacos apresentam limitações como elevada toxicidade, por interferirem com os microtúbulos de células não tumorais, e possibilidade de aquisição de resistência aos mesmos. De modo a ultrapassar estas limitações desenvolveram-se inibidores de proteínas envolvidas na mitose, como a kinesin spindle protein (KSP) e Aurora B. KSP é uma cinesina essencial para a bipolaridade do fuso mitótico, cuja inibição provoca paragem prolongada em mitose devido à ativação do spindle assembly checkpoint (SAC), provocando morte celular. Por seu lado, Aurora B é uma quinase essencial para a correta segregação cromossómica e citocinese. A sua inibição causa uma curta paragem em mitose que é rapidamente ultrapassada aumentando a poliploidia e levando à morte celular. No entanto, apesar dos resultados promissores in vitro, estes fármacos falharam em ensaios clínicos devido principalmente à falta de eficácia e ao slippage, fenómeno pelo qual a célula saia da mitose sem que se originem duas células filhas. Assim, para prevenir slippage e potenciar a morte celular propôs-se neste trabalho combinar inibidores de KSP ou Aurora B com um inibidor de proteínas pro-sobrevivência da família BCL-2, Navitoclax, ou com Cetuximab, um inibidor do recetor epidermal growth factor receptor (EGFR), envolvido na proliferação celular. A primeira abordagem terapêutica, com Navitoclax em combinação com inibidores de KSP ou Aurora B, avaliada em células de cancro oral, demonstrou efeitos sinérgicos aumentando a morte celular durante a mitose ou a morte celular pós-slippage, respetivamente. A eficácia destas abordagens foi também testada em esferóides 3D monotípicos tendo demonstrado efeitos aditivos não se tendo observado aumento de sinalização apoptótica. Estes resultados demonstram a necessidade de avaliação das abordagens terapêuticas em modelos mais complexos e que melhor mimetizam os tumores. A segunda abordagem com Cetuximab foi testada em modelo 2D de células de cancro oral e levou a efeitos sinérgicos tanto com inibidores de KSP como com inibidores de Aurora B observando-se um aumento de células apoptótica para ambas as combinações. Estes resultados demonstram o potencial de estratégias de combinação de fármacos antimitóticos e de promotores de apoptose ou inibidores de proliferação celular.; Head and neck cancer is among the most prevalent malignancies worldwide, with oral cancer being the most common and lethal subtype. Despite minor improvements in patient survival, oral cancer patients with advanced stages continue to exhibit poor prognosis and low survival rates. Therefore, the development of novel therapeutic strategies is critical for improving treatment outcomes. Anti-microtubule agents (MTAs) have been extensively utilized in oral cancer treatment, primarily in combinatorial regimens. However, these agents present significant limitations, including high toxicity due to their impact on microtubules in non-tumoral cells and the potential for tumor cells to develop resistance. To address these challenges, inhibitors targeting key mitotic regulators, such as kinesin spindle protein (KSP) and Aurora B, have been developed. KSP, a kinesin essential for mitotic spindle bipolarity, plays a crucial role in microtubule crosslinking and chromosome alignment. Its inhibition leads to monopolar spindle formation, sustained spindle assembly checkpoint (SAC) activation, and prolonged mitotic arrest, ultimately resulting in mitotic cell death. Aurora B is a kinase critical for proper chromosome segregation and cytokinesis. Inhibition of Aurora B induces a transient mitotic arrest, which is rapidly bypassed increasing polyploidy and promoting cell death. Despite promising in vitro efficacy, these inhibitors have demonstrated limited success in clinical trials, likely due to low efficacy and mitotic slippage, process by which mitotic cells exit mitosis without successful cytokinesis. To enhance cell death and prevent slippage, this study explored the combination of KSP or Aurora B inhibitors with either Navitoclax, an antiapoptotic BCL-2 family protein inhibitor that promotes apoptosis, or Cetuximab, an inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR), involved in cell proliferation. The first treatment approach, involving the combination of KSP or Aurora B inhibitors with Navitoclax, was assessed in 2D cultured oral cancer cells and exhibited synergistic effects, either prolonging mitotic arrest and enhancing mitotic cell death or increasing post-slippage apoptosis, respectively. Further evaluation in 3D monotypic spheroid models demonstrated primarily additive effects, with no significant increase in apoptotic response. These findings underscore the need of evaluating drugs using models that better mimic patient tumors to better predict therapeutic efficacy. The second approach, investigating Cetuximab in 2D oral cancer cell cultures, revealed synergistic interactions with both KSP and Aurora B inhibitors, leading to an increase in apoptotic cell populations for both combinations. These results highlight the potential of combinatorial strategies targeting mitotic regulators and apoptosis or proliferation pathways in oral cancer treatment.

2025-01-01T00:00:00Z Ferreira, Sónia Manuel Viegas http://hdl.handle.net/20.500.11816/4927 2025-11-27T03:00:08Z 2025-01-01T00:00:00Z

Natural hydrogels as an Intracanal Therapeutic Tool - combination of antimicrobial and photodynamic therapies to prevent reinfections Ferreira, Sónia Manuel Viegas As infeções endodônticas são predominantemente causadas por microrganismos formadores de biofilme, que apresentam uma notável resistência às estratégias convencionais de desinfeção. Entre estes, o Enterococcus faecalis (E. faecalis) está fortemente associado a infeções persistentes ou secundárias, devido à sua adaptabilidade e capacidade de formar o biofilme. Neste contexto, o desenvolvimento de medicamentos intracanalares eficazes continua a ser uma prioridade clínica. A curcumina, um composto natural extraído da Curcuma longa, apresenta atividade antimicrobiana de largo espectro e potencial fotossensibilizador adequado para a terapia fotodinâmica (PDT). No entanto, a sua baixa solubilidade em água e instabilidade química limitam a sua aplicação direta. Para ultrapassar estas limitações, este trabalho teve como objetivo desenvolver uma formulação intracanalar inovadora, baseada em nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) contendo curcumina, incorporadas num hidrogel biocompatível para potenciar a sua libertação e ativação pela PDT. As SLNs, compostas por cetil palmitato e estabilizadas com Tween® 80, foram produzidas por ultrassonicação a quente. As nanopartículas apresentaram tamanhos médios em torno de 200 nm e cargas superficiais de −25 mV. Ensaios de libertação in vitro confirmaram a libertação controlada da curcumina ao longo de um período de 100 horas, e a atividade antioxidante foi validada através dos ensaios ABTS e DPPH. Os estudos antimicrobianos revelaram que a curcumina livre reduziu significativamente a viabilidade plantónica de E. faecalis nas primeiras 24 horas, embora este efeito tenha diminuído com o tempo. Em contraste, observaram-se efeitos antimicrobianos sustentados a baixas concentrações, com as SLNs contendo curcumina a reduzirem a viabilidade bacteriana plantónica para 3% e a atividade metabólica séssil para 12%, após 72 horas, a uma concentração de 2,5 µg/mL. Os ensaios de citocompatibilidade realizados em fibroblastos gengivais humanos confirmaram uma biocompatibilidade aceitável para concentrações até 2,5 µg/mL. Estas nanopartículas foram integradas com sucesso num hidrogel de alginato de sódio/poli(álcool vinílico), formando um sistema injetável e fotoresponsivo. A caracterização físico-química confirmou a libertação controlada da curcumina durante 72 horas e propriedades reológicas adequadas para aplicação intracanalar. A atividade antibiofilme foi avaliada contra o E. faecalis, revelando uma redução bacteriana superior nos grupos fotoativados (PhAc) em comparação com os grupos não fotoativados (non-PhAc) e controlos. Adicionalmente, todas as formulações mantiveram a viabilidade dos fibroblastos mesmo após a exposição à luz, evidenciando a sua biocompatibilidade. Em suma, o hidrogel desenvolvido com SLNs contendo curcumina representa uma estratégia terapêutica promissora como medicação intracanalar, combinando nanotecnologia e ativação fotodinâmica para melhorar a desinfeção, reduzir o risco de reinfeção e promover a preservação tecidular nos tratamentos endodônticos.; Endodontic infections are predominantly caused by biofilm-forming microorganisms that exhibit remarkable resistance to conventional disinfection strategies. Among them, Enterococcus faecalis (E. faecalis) is highly associated with persistent or secondary infections due to its adaptability and biofilm-forming ability. In this context, the development of effective intracanal medicaments remains a clinical priority. Curcumin (CUR), a natural compound extracted from Curcuma longa, presents broad-spectrum antimicrobial activity and photosensitizing potential suitable for photodynamic therapy (PDT). However, its low water solubility and chemical instability limit its direct application. To address these limitations, this work aimed to develop an innovative intracanal formulation based on curcumin-loaded solid lipid nanoparticles (SLNs), incorporated into a biocompatible hydrogel for enhanced delivery and PDT activation. SLNs composed of cetyl palmitate and stabilized with Tween® 80 were produced by hot ultrasonication, showing mean sizes around 200 nm and surface charges of −25 mV. In vitro release assays confirmed the controlled release of CUR over a 100-hour period, and antioxidant activity was validated using ABTS and DPPH assays. Antimicrobial studies revealed that free CUR significantly reduced planktonic E. faecalis viability within 24 hours, but this effect decreased over time. In contrast, sustained antimicrobial effects were observed at low concentrations, with CUR-loaded SLNs reducing planktonic bacterial viability to 3% and sessile metabolic activity to 12% after 72 hours at 2.5 µg/mL. Cytocompatibility testing on human gingival fibroblasts confirmed acceptable biocompatibility for concentrations up to 2.5 µg/mL. These nanoparticles were successfully integrated into a sodium alginate/polyvinyl alcohol hydrogel, forming an injectable and photo-responsive system. Physicochemical characterization confirmed the sustained release of CUR over 72 hours and suitable rheological properties for intracanal application. Antibiofilm activity was assessed against E. faecalis, demonstrating superior bacterial reduction in photoactivated (PhAc) groups compared to non-photoactivated (non-PhAc) and control conditions. Additionally, the formulations revealed significant antioxidant activity and maintained cytocompatibility in human fibroblasts, even after light exposure. Overall, the developed CUR-loaded SLN hydrogel represents a promising intracanal therapeutic strategy, combining nanotechnology and photodynamic activation to enhance disinfection, reduce reinfection risks, and support tissue preservation in endodontic therapy.

2025-01-01T00:00:00Z Pacheco, Ana Catarina da Silva http://hdl.handle.net/20.500.11816/4926 2025-11-08T03:00:08Z 2025-01-01T00:00:00Z

Co-targeting of cancer glycolytic metabolism and angiogenesis through polymeric nanoparticles for glioblastoma therapy. Pacheco, Ana Catarina da Silva O glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral primário letal, com sobrevivência mediana de apenas 15-18 meses, mesmo após ressecção cirúrgica máxima, radioterapia e quimioterapia com temozolomida. A eficácia terapêutica permanece limitada por mecanismos de resistência e pela baixa penetração de fármacos através da barreira hematoencefálica. Nanosistemas multifuncionais surgem como soluções promissoras para ultrapassar estes desafios. Permitem a entrega de fármacos em combinações sinérgicas, ajustes na biodistribuição, com maior acumulação tumoral, e proteção de degradação enzimática. Isto é especialmente importante para ácidos nucleicos e macromoléculas, cuja eficácia anti-GBM se perde frequentemente na translação pré-clínica-clínica devido à rápida degradação ou baixa permeabilidade cerebral. Desde 2009, o bevacizumab é aprovado pela FDA como terapia anti-angiogénica para GBM recorrente. Contudo, o efeito terapêutico é limitado pela baixa penetração cerebral e por adaptações metabólicas tumorais, nomeadamente intensificação da glicólise em zonas de fraca perfusão. Neste contexto, esta tese apresenta o desenvolvimento e validação pré-clínica das BDNP: nanopartículas para co-entrega de bevacizumab e dicloroacetato, inibidor da glicólise, por via intranasal. A superfície das BDNP foi funcionalizada com o péptido AP-9, que se liga à CD147, para aumentar a retenção das nanopartículas no tecido tumoral. As BDNP apresentaram características físicas uniformes e reprodutíveis, ~200 nm, carga neutra, com retenção eficiente de bevacizumab, ~60%, e dicloroacetato, ~40%. À semelhança do bevacizumab livre, as BDNP inibiram eficazmente a tubulogénese endotelial induzida por linhas celulares de GBM e neuroesferas derivadas de pacientes, além de reduzir a vascularização da membrana corioalantóica de embriões de galinha. Adicionalmente, as BDNP preveniram a hiperglicólise induzida por bevacizumab, mantendo taxas de consumo de oxigénio e de acidificação extracelular comparáveis às de células não tratadas. In vitro, a funcionalização com AP-9 aumentou a retenção das nanopartículas em células tumorais, embora in vivo não tenha melhorado significativamente a acumulação tumoral ou eficácia terapêutica. Após administração intranasal em ratinhos com tumores U-251MG, as BDNP acumularam-se rapidamente no cérebro e no tecido peri-tumoral. Tratamentos intranasais semanais aumentaram significativamente a sobrevivência dos animais, sem toxicidade sistémica detetável. Um comportamento semelhante foi observado num modelo de GBM em ratinho estabelecido com neuroesferas derivadas de pacientes. Além de apresentar o desenvolvimento das BDNP e resultados da validação pré-clínica, esta tese discute os desafios enfrentados, bem como as suas limitações. Destaca-se a necessidade de testar o sistema em modelos ortotópicos imunocompetentes e avaliar o perfil farmacocinético. Compara-se as BDNP com sistemas similares e propõem-se estratégias para aumentar o potencial de translação clínica.; Glioblastoma (GBM) is a lethal primary brain tumor with a median survival of only 15-18 months despite maximum surgical resection, radiotherapy and temozolomide-based chemotherapy. Therapeutic efficacy remains limited by resistance mechanisms and poor drug penetration across the blood-brain barrier. Multidrug nanosystems have emerged as a promising strategy to overcome these barriers, enabling synergistic drug delivery, improved biodistribution, enhanced tumor accumulation, and protection against enzymatic degradation. Such abilities are particularly important for nucleic acids and macromolecules, whose anti-GBM efficacy is often lost in preclinical-to-clinical translation by rapid degradation or brain impermeability. Since 2009, bevacizumab has been FDA-approved as an anti-angiogenic therapy for recurrent GBM. However, its therapeutic benefit is hindered by limited brain penetration and tumor metabolic adaptation, notably glycolysis upregulation in poorly perfused regions. To address these challenges, this thesis reports the development and preclinical evaluation of BDNP, a novel nanoparticle system co-delivering bevacizumab and the glycolysis inhibitor dichloroacetate via intranasal administration. BDNP surface was functionalized with AP-9, a CD147-targeting peptide, to improve nanosystem retention in tumor tissue. BDNP exhibited uniform and reproducible physical characteristics, ~200 nm diameter, neutral charge, with efficient entrapment of bevacizumab, ~60%, and dichloroacetate, ~40%. In vitro studies, using GBM cell lines and patient-derived neurospheres, confirmed BDNP’s ability to inhibit endothelial tubulogenesis similarly to free bevacizumab and reduce vascularization in the chick chorioallantoic membrane model. BDNP also attenuated bevacizumab-induced metabolic shifts, preserving oxygen consumption and extracellular acidification rates comparable to bevacizumab-naïve cells. Surface functionalization with AP-9 enhanced nanoparticle uptake in CD147-expressing tumor cells in vitro, although it did not significantly improve tumor accumulation or therapeutic outcomes in vivo. Following intranasal delivery in U-251MG tumor-bearing mice, BDNP accumulated in the brain and peri-tumoral regions. Weekly treatment improved survival without systemic toxicity. A similar benefit was observed in mice bearing patient-derived neurospheres. In addition to presenting BDNP's formulation and promising preclinical outcomes, in this thesis, we provided an honest appraisal of the challenges faced during nanoparticle design and validation, as well as its limitations. The need to test the system in immunocompetent orthotopic GBM models and to evaluate pharmacokinetics are highlighted. Comparisons with similar platforms and proposals for enhancing clinical translation potential are also provided.

2025-01-01T00:00:00Z