http://hdl.handle.net/20.500.11816/1899 Sat, 04 Apr 2026 05:54:02 GMT 2026-04-04T05:54:02Z http://hdl.handle.net/20.500.11816/2541 Unravelling the molecular mechanismsunderlying 3-bromopyruvate resistance in tumor cell lines Barbosa, Ana Margarida Oliveira As células tumorais apresentam na sua maioria uma reprogramação metabólica, que consiste na alteração da produção de energia, ou seja, deixam de utilizar a fosforilação oxidativa, e passam a recorrer à glicólise, mesmo na presença de oxigénio. Esta alteração metabólica é designada por Efeito de Warburg. O 3- bromopiruvato (3-BP) é um composto antitumoral que altera o metabolismo da glucose e inibe a produção de energia nas células tumorais, atuando quer na glicólise, quer a nível mitocondrial. Contudo, apesar de existirem vários tipos de cancro afetados pelo 3-BP, têm sido descritos alguns casos de resistência. Os mecanismos envolvidos no desenvolvimento dessa resistência encontram-se ainda por esclarecer, pelo que a identificação dos principais mecanismos pode vir a ter uma grande importância para a descoberta de novos alvos e estratégias terapêuticas. Assim, o objetivo do presente estudo foi criar uma linha celular resistente ao 3-BP, de forma a compreender os mecanismos moleculares envolvidos nessa resistência. A linha celular ZR-75-1, uma linha celular de cancro de mama anteriormente caracterizada como sendo sensível ao 3-BP, foi escolhida como linha celular parental. A linha celular ZR-75-1 resistente ao 3-BP (ZR-75-1-R) foi estabelecida expondo as células a concentrações crescentes do fármaco. A resistência adquirida ao longo do tempo foi acompanhada através de ensaios SRB. Aproximadamente 12 meses depois, as células ZR-75-1-R foram obtidas com um índice de resistência final de 4, relativamente à respetiva linha celular parental, denominada ZR-75-1-S. Verificou-se que as células das linhas ZR-75-1-S e ZR-75-1- R apresentavam diferenças em condições basais, nomeadamente na morfologia celular (citoplasma opaco, células mais pequenas e um aumento do número de vacúolos), na migração (as células ZR-75-1-R apresentaram uma maior capacidade de migração) e no metabolismo (as células ZR-75-1-R apresentaram uma menor capacidade em produzir/exportar lactato). No que diz respeito à resposta ao 3-BP, foram também observadas diferenças em ambos os tipos de células, nomeadamente no efeito do 3-BP na migração celular e no consumo de glucose, para além do efeito na citotoxicidade já referido. O 3-BP levou a uma considerável diminuição da migração celular na linha celular ZR-75-1-S, contrariamente ao que sucedeu com a linha ZR- 75-1-R, onde não foram observadas diferenças significativas entre as células tratadas e não tratadas com 3-BP. Relativamente ao metabolismo celular, o 3-BP levou a uma diminuição no consumo de glucose, quer nas células ZR-75-1-S, quer nas células ZR- 75-1-R, embora esse efeito tenha sido mais notório na linha celular parental. O efluxo de lactato não foi fortemente afetado pelo 3-BP, nem na linha ZR-75-1-S, nem na linha ZR-75-1-R. De forma a determinar a influência dos transportadores de monocarboxilatos (MCTs), especialmente das isoformas 1 e 4, na resistência ao 3-BP, analisou-se a sua expressão, através da técnica de Western Blot. Relativamente ao MCT4, a sua expressão foi observada em todas as linhas celulares, mas não foram detetadas diferenças significativas entre as linhas celulares resistentes e as respetivas células parentais. Quanto ao MCT1, este ensaio não se encontrava otimizado e, por isso, não foi possível concluir acerca da sua contribuição. Uma vez que a criação de uma linha celular resistente a um composto leva frequentemente a uma resistência cruzada a outros compostos, este trabalho teve também como objetivo verificar se este fenómeno aconteceu com a linha celular resistente ao 3-BP. Foi encontrada uma maior resistência a outros compostos com ação antitumoral nas células ZR-75-1-R, nomeadamente à 2-desoxiglucose, iodoacetato e doxorrubicina, mas não ao dicloroacetato, mostrando assim que a resistência adquirida não era específica do 3-BP. Dado que estes compostos têm alvos e estruturas diferentes do 3-BP, nomeadamente a doxorrubicina, é possível que se tenha desenvolvido um complexo mecanismo de resistência. Finalmente, observou-se que a resistência adquirida ao 3-BP pelas células ZR-75-1-R pode ser revertida com recurso a uma pré incubação, com ácido butírico durante 24 horas, tal como tinha sido anteriormente verificado no nosso laboratório com a linha celular de cancro de mama SK-BR-3, que é uma linha celular com uma resistência intrínseca a este composto. Paralelamente, investigou-se o efeito do 3-BP em glioblastomas, um cancro muito agressivo e com elevadas taxas glicolíticas, utilizando as linhas celulares U373MG, U87MG e U251MG. As três linhas celulares apresentaram diferentes sensibilidades ao 3-BP: U373MG ~ U87MG > U251MG. Observou-se também que o efeito citotóxico do 3-BP é ligeiramente superior a valores de pH extracelular mais baixos. Relativamente ao metabolismo celular, foi observada uma redução na produção de lactato, no consumo de glucose e na capacidade de migração. A avaliação da expressão de proteínas envolvidas no mecanismo de ação do 3-BP, nomeadamente do MCT1 e do MCT4, não mostrou nenhuma evidência direta entre essa expressão e a citotoxicidade do 3-BP, apesar de todas as linhas celulares apresentarem expressão de ambos os transportadores. Resumidamente, a linha celular resistente ao 3-BP foi criada com sucesso. Esta linha celular apresentou alterações, comparativamente à linha celular parental, em condições basais (morfologia, migração celular e produção/efluxo de lactato), na resposta ao 3-BP (toxicidade, migração celular e no metabolismo da glucose) e na resistência a outros compostos (2-desoxiglucose, iodoacetato e doxorrubicina). Contudo, o fenótipo resistente da linha celular não é irreversível, uma vez que pode ser revertido com uma pré incubação com ácido butírico. Nos glioblastomas também foi observado que o 3-BP induz a morte celular, nomeadamente a valores de pH mais baixos, inibe a migração celular e o metabolismo da glucose, levando a um consumo menor e a uma menor produção de lactato e/ou do seu efluxo. A influência dos MCTs 1 e 4 no efeito do 3-BP não parece ser evidente, nem na linha celular resistente, nem nos glioblastomas. Por isso, no futuro, outros ensaios deverão ser realizados para avaliar a localização e atividade dos MCTs, e perceber qual o seu papel no mecanismo de ação do 3-BP. Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/20.500.11816/2541 2016-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/20.500.11816/1983 Influência dos Polimorfismos dos genes MCT1 e MCT4 e da sua expressão no efeito do 3-BP em células tumorais Miranda, Joana Catarina Vieira As células tumorais recorrem essencialmente à glicólise aeróbia para a obtenção da energia necessária para a sua proliferação celular, sendo esta adaptação metabólica designada por "Efeito de Warburg". O lactato produzido neste processo é transportado para o exterior das células pelos transportadores de ácidos monocarboxílicos (MCTs), aumentando dessa forma a acidez do microambiente tumoral e permitindo a sobrevivência das células tumorais. Recentemente, foram identificados Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) nos genes codificantes dos MCTs, nomeadamente no MCT1 e MCT4, que podem originar alterações na atividade destes transportadores, em particular no que se refere ao efluxo de lactato. Nos últimos anos têm sido desenvolvidos vários compostos com ação antitumoral, com diversos alvos terapêuticos, sendo a atividade metabólica da célula tumoral, um excelente alvo no desenvolvimento de terapias mais direcionadas. Entre esses compostos encontra-se o 3-bromopiruvato (3- BP), um inibidor metabólico derivado do piruvato, presumivelmente transportado pelos MCTs e que tem como alvo principal a enzima hexocinase II (HK II). A inibição da HK II, pela ação do 3-BP, reduz os níveis de ATP e NADPH e bloqueia o processo de glicólise em células tumorais, diminuindo ou impossibilitando a sua proliferação. No presente estudo, foi realizada a genotipagem dos polimorfismos T1470A (presente no gene MCT1) e C44T (presente no gene MCT4) num painel alargado de linhas celulares tumorais. Uma vez que as células tumorais apresentam elevadas taxas glicolíticas e os MCTs desempenham um papel fundamental no seu metabolismo e na ação do 3-BP, pretendeu-se avaliar o efeito citotóxico deste composto nas linhas em estudo e correlacionar esse efeito com a expressão dos MCTs e com a presença dos polimorfismos referidos. Os resultados obtidos através da avaliação da toxicidade do 3-BP mostraram que a sensibilidade ao composto foi distinta entre os diferentes tipos de cancro em análise. As linhas tumorais HCT-15 de adenocarcinoma colorretal e HeLa de adenocarcinoma cervical mostraram ser as mais sensíveis ao composto. Pelo contrário, as linhas SCCO9 e SCC25 de adenocarcinoma da cavidade oral, apresentaram-se como as mais resistentes ao 3-BP, sendo que em ambas foi impossível determinar o valor exato de IC50. Relativamente à expressão das proteínas MCT1 e MCT4, todas as linhas tumorais utilizadas apresentaram expressão destes transportadores, à exceção da linha MDA-MB-231 que não apresentou expressão de MCT1. Os níveis de expressão das proteínas MCT1/MCT4 mostraram ser significativos em todas as linhas tumorais, principalmente nas linhas tumorais de carcinoma da cavidade oral e de adenocarcinoma hepatocelular. IX Influência dos polimorfismos dos genes MCT1 e MCT4 e da sua expressão no efeito do 3-BP em células tumorais Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/20.500.11816/1983 2016-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/20.500.11816/388 Screening for small molecules with potential antitumour activity and characterization of the antimitotic activity of a prenylated chalcone in NCI-H460 non- small cell lung cancer cells Fonseca, Joana Cristina Rodrigues da Cancro é um dos principais problemas de saúde, com grande mortalidade e morbilidade pelo mundo fora, devido ao aumento da sua incidência. Assim, a necessidade de desenvolver novas terapias torna-se mais evidente, tal como o melhoramento das terapias convencionais, principalmente a quimioterapia, de forma a melhorar a qualidade de vida e os efeitos nos pacientes. Alguns dos fármacos quimioterápicos usados nos tratamentos de cancro de hoje em dia são fármacos antimitóticos, como as vinca alcaloides e os taxanos, capazes de interferirem com a dinâmica dos microtúbulos e, assim, causar paragem da mitose e, eventualmente, morte celular O presente trabalho teve dois objetivos: i) screening da actividade anti proliferativa de vinte e dois compostos sintéticos (quatro com actividade antiproliferative potente, nove com actividade moderada, e nove com pouca ou nenhuma actividade), fornecidos pelo CEQUIMED-UP; ii) avaliação de potencial atividade antimitótica dos quatro compostos testados com alta atividade antiproliferative, juntamente com três compostos, cuja atividade antiproliferative já havia sido publicada; e iii) caracterização do mecanismo de acção antiproliferative de uma chalcona prenilada, chamada de 2PC, também fornecido pelo CEQUIMED-UP, previamente identificada como um potente inibidor de crescimento de linhas celulares cancerígenas. O screening dos compostos foi realizada com três linhas celulares: A375-C5 (melanoma maligno), MCF-7 (adenocarcinoma da mama) e NCI-H460 (carcinoma do pulmão de células não-pequenas). O screening revelou quatro compostos (C1P2O, C6, F3,7 GluAc e XGluAc) com potente actividade de inibição de crescimento. Destes quatro, em conjunto com três compostos cuja actividade antiproliferative havia sido publicada, compostos 13, 16 e 2PC, foram testados para actividade antimitótica. Dos sete compostos testados, apenas C6 e 2PC mostraram actividade antimitótica. 2PC, uma nova chalcona prenilada, foi selecionada para caracterização adicional do mecanismo de acção na linha celular de NCI-H460. O tratamento das células de NCIH460 com 2PC mostrou um aumento das células paradas em mitose, devido ao colapso dos pólos do fuso mitótico. Esta paragem da mitose é provocada pela activação do spindle assembly checkpoint, como pode ser visto pela acumulação das proteínas BubR1 e MAD2 nos cinetocóros. A acção de 2PC sobre as células de NCI-H460 é irreversível, visto que as células permanecem incapazes de a progredir após a remoção do composto a partir do meio. Células tratadas com 2PC sofrem paragem prolongada da mitose, como pode ser visto através de live cell imaging, resultando em catástrofe mitótica, por meio de apoptose. A realização de ensaios MTT sobre a acção combinada de 2PC e paclitaxel revelaram actividade sinérgica entre os dois compostos, como 2PC sensibiliza as células NCI-H460 para a acção do paclitaxel. Através destas características observadas, 2PC tem mostrado efeitos interessantes sobre cancro, a solo e como composto de combinação. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/20.500.11816/388 2015-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/20.500.11816/387 Desenvolvimento de micro e nanopartículas para o encapsulamento de EGCG: estudo exploratório Nunes, Joana Isabel Ferreira O chá verde é produzido a partir das folhas da planta Camellia sinensis, e tem sido associado a muitos benefícios na saúde, incluindo a prevenção e tratamento de patologias como cancro, obesidade, diabetes, infeções bacterianas e virais, entre outras. Muitos dos efeitos benéficos do chá verde estão relacionados com a atividade das suas catequinas, nomeadamente a (-)-epigalocatequina galato (EGCG), que é um dos seus principais componentes. Há cerca de 20 anos, que se desenvolvem estudos para revelar as atividades biológicas e mecanismos de ação do chá verde e do EGCG. Sabe-se que muitos dos potenciais efeitos do EGCG têm sido fortemente limitados devido à sua baixa biodisponibilidade e estabilidade, o que dificulta o desenvolvimento de aplicações nutracêuticas ou terapêuticas. Neste sentido, no presente estudo pretendeu-se encapsular o composto EGCG de forma a torna-lo mais biodisponível e estável. Devido ao facto de este composto não apresentar uma solubilidade total em água, foram abordados dois métodos distintos de encapsulação. Por um lado, foram desenvolvidas várias formulações de micropartículas de isolado proteico de soja (IPS) e alginato pelo método de emulsificação/gelificação; e por outro, foram desenvolvidas nanopartículas de lípidos sólidos (NLS) pelo método da dupla emulsão. Como resultado do estudo da encapsulação do EGCG em micropartículas de IPS/alginato obtiveram-se partículas com tamanhos pequenos (entre 16,34 e 24,21µm), com uma boa eficiência de encapsulação (entre 62,41 e 99,72), no entanto, não foi possível avaliar a sua atividade antioxidante. Por sua vez, como resultado da encapsulação do EGCG em NLS conclui-se que nas condições estudadas não foi possível obter-se nanopartículas, mas sim partículas na gama dos micrometros (entre 913,8 ± e 1488,4 nm) no entanto, obtiveram-se partículas com uma boa eficiência de encapsulação (entre 90,06 e 95,58%) e com uma boa capacidade antioxidante (entre 91,01 e 97,02%). Foi desenvolvido e validado um método de cromatografia líquida de alta eficiência, para quantificação de EGCG de forma a permitir a aplicação em estudos de formulação, estabilidade e mesmo farmacocinéticos e farmacodinâmicos. Por fim, foi possível concluir que os dois métodos estudados apresentaram resultados promissores para o encapsulamento do EGCG. No entanto, é importante salientar que este estudo foi exploratório, sendo necessário o desenvolvimento de estudos adicionais de forma a garantir que esta linha de estudo é efetivamente eficiente para encapsulação, estabilização e entrega do composto. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/20.500.11816/387 2015-01-01T00:00:00Z