RNA and microRNA profiling for the determination of post mortem interval

Abstract

O Intervalo post mortem (PMI) representa o período de tempo decorrido entre a morte e a altura em que o cadáver é encontrado. A determinação precisa do PMI é uma das informações mais importantes na altura da autópsia, sendo crucial para a investigação criminal, civil e forense. Apesar da variadíssima literatura acerca deste assunto, a determinação precisa do PMI ainda apresenta muitas dificuldades, mesmo para patologistas experientes. Atualmente, existem múltiplas técnicas para determinar o PMI que englobam métodos de várias áreas das ciências forenses. Os patologistas forenses avaliam normalmente processos físicos (temperatura corporal, livor mortis), físico-químicos (rigor mortis), bioquímicos (concentração de eletrólitos, atividade enzimática), microbiológicos (decomposição) e entomológicos. No entanto, todos estes métodos são imprecisos no cálculo do PMI, dando-nos na melhor das hipóteses uma estimativa, que só deverá ser aceite após a consideração de todos os fatores que possam influenciar os resultados. Idealmente, para determinar de forma precisa o PMI, será necessário um parâmetro que altere constantemente, o qual se possa correlacionar com o tempo da morte. A degradação post mortem dos ácidos nucleicos parece ter esta característica. Com os avanços da biologia molecular, a análise da degradação ao longo do tempo dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) tem desempenhado um papel fundamental na medicina, assim como nas ciências forenses. Neste contexto, o potencial do RNA nas ciências forenses tem sido estudado com vários objetivos, como a identificação de fluidos corporais, a determinação do tempo das amostras biológicas através da análise da degradação do RNA e a determinação do PMI. A estimativa do PMI, baseada somente na degradação do mRNA, pode ser limitada por vários fatores físicos e químicos que ocorrem no momento na morte ou durante o PMI. Por outro lado, o perfil do microRNA (miRNA) oferece grandes vantagens quando comparado com o mRNA. Estas pequenas sequências de RNA não codificante têm demostrado uma maior estabilidade e são muito mais sensíveis e específicas do que todos os métodos usados em ciências forenses para a quantificação de mRNA. Contudo, o seu potencial na estimativa do PMI é, até agora, desconhecido. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a degradação do RNA e do miRNA em diferentes matrizes biológicas, assim como desenvolver um modelo matemático que possa ser usado como método auxiliar para uma determinação mais x precisa do PMI. Foi proposta uma avaliação combinada da degradação do mRNA e do miRNA, o que poderá trazer grandes vantagens em relação aos métodos atuais, uma vez que não existe um método fiável e preciso para estimar o PMI. Foi realizada uma cinética de 11 horas, com um “checkpoint” a cada hora para análise do RNA total extraído do coração, musculo esquelético, fígado e pâncreas de um modelo murino. O perfil de degradação do RNA total foi avaliado no RNA electrophoresis (ExperionTM Bio-Rad), através do indicador da qualidade do RNA (RQI). A transcrição de vários genes referência (Tropomiosina, Albumina, Beta-Actina, GAPDH, 18S rRNA, HPRT, Ciclofilina, BHMT, MLCK, SRP72, Cyp2E1 e RPS29) foi analisada através de PCR quantitativo em tempo real e expressa pelos valores de threshold cycle (Ct). Para diminuir possíveis erros, todos os resultados foram normalizados relativamente aos valores de Ct do gene RPS29. A análise quantitativa da transcrição nestes órgãos permitiu a identificação de genes que se correlacionam com o PMI de forma específica em cada órgão. Exceto a Tropomiosina e a Cyp2E1, todos os genes demonstraram uma degradação gradual com o tempo no músculo-esquelético, enquanto no coração não foi encontrada qualquer correlação significativa. Além disso, a Albumina, o GAPDH e a Cyp2E1 foram identificados no fígado como tendo a melhor correlação (p<0,0001). Contrariamente, todos os miRNA estudados permaneceram inalterados durante o PMI, o que confirma a sua alta estabilidade. A relação destes genes estáveis (miRNA) com os degradáveis (mRNA) será usada para o desenvolvimento de um modelo matemático com valor preditivo na determinação do PMI. Este estudo poderá fornecer um novo paradigma na estimativa do PMI e tornarse num método complementar aos tradicionais. O modelo matemático será, posteriormente, aplicado em amostras recolhidas a partir de cadáveres intatos de ratinho, sendo mais tarde testado e validado em amostras humanas post mortem.