Quantification of metabolites of kinureninergic pathway and inflammatory biomarkers in biological samples of cardiac patients with heart failure: an exploratory pilot study

Abstract

O triptofano (TRP) tem um papel importante na síntese de proteínas e de várias substâncias biologicamente ativas. É metabolizado pela via da quinurenina, produzindo uma série de metabolitos ativos tais como o ácido quinurénico (KA), L-quinurenina (KYN), entre outros. Os metabolitos do TRP estão relacionados com processos biológicos como a inflamação, a excitabilidade neuronal, o crescimento celular, o stress oxidativo e a divisão celular. Além disso, existem evidências recentes que indicam que os metabolitos do TRP desempenham um papel relevante na fisiopatologia das doenças cardiovasculares através de mecanismos inflamatórios e de stress oxidativo. A quantificação do TRP e dos seus metabolitos em amostras biológicas pode ser uma poderosa ferramenta para compreender os mecanismos da doença. Assim sendo, é de suma importância desenvolver métodos analíticos capazes de quantificar o TRP e seus metabolitos para que juntamente com parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios seja possível monitorizar a progressão da doença, sendo também útil em medicina forense. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a validação de um método analítico de cromatografia líquida com detetor UV-Vis e fluorescência (FD) (LC-UV-Vis/FD) para análise do TRP, KYN e KA em amostras de urina de doentes com insuficiência cardíaca (IC). Além disso, foram quantificados parâmetros bioquímicos e marcadores inflamatórios utilizando um analisador automático Prestige 24i e um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) que foi utilizado para a determinação dos níveis plasmáticos do peptídeo natriurético do cérebro (BNP) correlacionando os dados com os valores do TRP e dos seus metabolitos. As condições otimizadas do método LC-UV-Vis/FD foram conseguidas utilizando uma coluna analítica, Luna® 3 µm PFP, uma fase móvel constituída por 20 mM de formato de amónia em água ultra pura (com 0,01 % de ácido fórmico), acetonitrilo e etanol (95/2/3, v/v/v), um fluxo de 0,7 mL/min e uma temperatura de 25ºC no forno de coluna. Foi utilizado um programa de comprimento de onda (λ) para o detetor de UV fixado a 365 nm para a KYN e para a 3-nitrotirosina utilizada como padrão interno, e 344 nm para o KA. Para o detetor FD foi utilizado λ de excitação e emissão de 280 nm e 365 nm, respetivamente para o TRP. O método foi validado de acordo com as normas da European Medicines Agency (EMA) em termos de seletividade, linearidade, limite de deteção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão, exatidão e recuperação. Os coeficientes de correlação (R2) foram superiores a 0,99 para todos os compostos. Os LD variaram entre 13,1 µg/mL para KYN e 21,6 µg/mL para TRP e KA. Os LQs foram de 39,8, 65,4 e 83,5 µg/mL para KYN, TRP e KA, respetivamente. O método demonstrou ser exato (82 a 116%) e preciso (abaixo de 15%) e as recuperações variaram entre 95 e 130%. O método foi aplicado para a quantificação do TRP e dos seus metabolitos em voluntários saudáveis e pacientes homens com IC. Os pacientes foram divididos em dois grupos, diabéticos (DM2/HF) e não diabéticos (HF). A concentração do TRP e dos seus metabolitos foram comparadas entre grupos. Os resultados mostraram que o grupo DM2/HF apresentou valores medianos de KYN mais elevados e KA mais baixos do que os voluntários saudáveis. Pelo contrário, foram encontrados valores medianos mais baixos destes metabolitos no grupo HF do que os dos pacientes DM2/HF e voluntários. As razões KYN/TRP e KA/KYN também foram determinadas. Os resultados apoiam a hipótese de que a razão KYN/TRP está relacionada com a atividade enzimática e que a razão KA/KYN pode ser um bom indicador neuroprotetor. Apesar dos dados do presente estudo terem sido obtidos a partir de um pequeno grupo de pacientes (estudo piloto), os resultados mostraram uma relação entre parâmetros bioquímicos, marcadores inflamatórios e alterações na concentração de TRP, KYN e KA e o potencial do método LC-UV-Vis/FD para a monitorização dos compostos selecionados em pacientes cardíacos.

Tryptophan (TRP) plays an important role in the synthesis of proteins and various biologically active substances. It is metabolized through the kynurenine pathway, producing a range of active metabolites such as kynurenic acid (KA), L-kynurenine (KYN), among others. TRP metabolites are closely related to processes such as inflammation, neuronal excitability, cell growth, oxidative stress and cell division. In addition, recent evidence indicates the relevant role of the TRP metabolites in the pathophysiology of cardiovascular diseases via inflammatory and stress oxidative mechanisms. Quantification of TRP and its metabolites in biological samples can be a powerful tool to elucidate the disease mechanisms. Therefore, it is of the utmost importance to develop analytical methods able to quantify TRP and its metabolites in biological matrices that together with biochemical parameters and inflammatory markers may allow monitor the progression of disease, being also useful in forensic medicine. Therefore, the aim of this work was to develop and validate a liquid chromatography with UV and fluorescence detector (FD) (LC-UV-Vis/FD) analytical method for analysis of TRP and its metabolites (KYN, KA) in urine samples from heart failure (HF) patients. Further, biochemical parameters and inflammatory markers were quantified using a Prestige 24i automated analyzer and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine plasma brain natriuretic peptide (BNP) levels and data correlated with TRP and its metabolite values. The LC-UV-Vis/FD optimized conditions were achieved using a Luna® 3 µm PFP analytical column, a mobile phase consisting in 20 mM of ammonium formate in ultra-pure water (with 0.01 % of formic acid), acetonitrile and ethanol (95/2/3, v/v/v), a flow rate of 0.7 mL/min and column oven set at 25ºC. A wavelength (λ) program was used for the UV detector set at 365 nm for KYN and 3-nitrotyrosine used as internal standard, and 344 nm for KA, while the FD was set to excitation and emission λ of 280 nm and 365 nm, respectively for TRP. The method was validated according to the European Medicines Agency (EMA) guidelines in terms of selectivity, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), precision, accuracy, and recovery. The correlation coefficients (R2) were above 0.99 for all compounds. LODs ranged from 13.1 µg/mL for KYN and 21.6 µg/mL for TRP and KA. The LOQs were 39.8, 65.4 and 83.5 µg/mL for KYN, TRP and KA, respectively. The method demonstrated to be accurate (82 to 116%), precise (below 15%) and recoveries varied from 95 and 130%. The method was applied to the quantification of TRP and its metabolites in healthy volunteers and male HF patients. Patients were stratified by diabetic (DM2/HF) and non-diabetic (HF) groups. Urinary values of TRP and its metabolites were compared between groups. Results showed that DM2/HF group presented higher KYN and lower KA median values than healthy volunteers. Instead, lower median values of these metabolites were found in HF group than those of the DM2/HF patients and volunteers. The KYN/TRP and KA/KYN ratios were also calculated. Results support the hypothesis that KYN/TRP ratio is related with enzymatic activity and that KA/KYN ratio can be a good neuroprotector indicator. Thought data from this study were obtained from a small group of patients (pilot study) results showed a relationship between biochemical parameters, inflammatory markers and changes in the concentration of TRP, KYN and KA and the potential of the LC-UV-FD method for the monitoring of the selected compounds in cardiac patients.