Therapeutic targeting of spindle assembly checkpoint silencing as a strategy to sensitize cancer cells to chemotherapy drugs.

Abstract

Os agentes anti-microtúbulos (MTAs) têm sido amplamente usados no tratamento do cancro. Ao interferir com a dinâmica dos microtúbulos, levam à ativação do checkpoint mitótico (SAC), provocando uma paragem em mitose. O SAC impede a transição metafase-anafase até os cromossomas se encontrarem corretamente ligados aos microtúbulos do fuso mitótico e alinhados na placa metafásica. Assim, espera-se que a ativação do SAC induzida pelos MTAs resulte em morte celular. Contudo, a resistência aos MTAs, nomeadamente devido ao seu efeito sobre os microtúbulos, limita a sua eficácia, permitindo às células escaparem à morte celular através da saída prematura da mitose, ou slippage. Deste modo, têm sido investigados antimitóticos alternativos que não interfiram com os microtúbulos. Os reguladores do SAC têm emergido como alvos atrativos, individualmente, ou em combinação com outros fármacos. De facto, a terapia de combinação tem sido usada para contornar a resistência aos fármacos. Na tese apresentada, a depleção da proteína silenciadora do SAC p31comet foi investigada como estratégia para potenciar a eficácia de fármacos anticancerígenos. Primeiro, o knockdown da p31comet foi avaliado em combinação com o MTA paclitaxel ou com o pró-apoptótico Navitoclax em células de cancro do pulmão de não pequenas células (CPNPC). O knockdown da p31comet aumentou a citotoxicidade do paclitaxel ou do Navitoclax através de mecanismos distintos. O knockdown da p31comet aumentou a duração da mitose em células tratadas com concentrações nanomolares de paclitaxel, levando a um efeito aditivo em termos de morte celular, que foi predominantemente antecipada durante a primeira mitose. Por outro lado, o pro-apoptótico Navitoclax acelerou a morte pós-mitose em células depletadas de p31comet. A eficácia desta estratégia foi posteriormente validada em esferóides 3D monotípicos. Assim, o knockdown da p31comet aumentou a citotoxicidade de doses clinicamente relevantes de paclitaxel ou Navitoclax em esferóides de CPNPC. Em segundo lugar, investigou-se a relevância clínica da p31comet no cancro oral. A expressão da p31comet foi averiguada em dados ómicos de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (CCECP), e relacionada com genes e vias de sinalização relevantes, bem como com características clínico-patológicas. A p31comet encontrava-se em amostras de CCECP, comparativamente a tecidos normais. Adicionalmente, a expressão da p31comet coincidiu com modificações em vias frequentemente desreguladas no cancro, e com alterações na cromatina, evidenciando a sua significância clínica. Observou-se também uma correlação positiva entre a p31comet e os seus parceiros Mad2 e TRIP13. Contudo, o impacto isolado da expressão da p31comet na sobrevivência dos pacientes de CCECP foi inconclusivo. Notavelmente, o knockdown da p31comet em células de carcinoma oral de células escamosas potenciou a citotoxicidade da cisplatina na linha mais resistência à cisplatina. Em suma, a inibição da p31comet é uma estratégia promissora que potencia a letalidade de fármacos antimitóticos e pro-apoptóticos em CPNPS, através de mecanismo distintos. Adicionalmente, a p31comet apresenta potencial relevância clínica no cancro oral e a combinação da inibição da p31comet com cisplatina merece ser explorada no cancro oral, num contexto de resistência à cisplatina. Este trabalho reforça a significância do uso do SAC como alvo no tratamento do cancro.

Microtubule-targeting agents (MTAs) have been widely used in cancer treatment. By interfering with microtubules, MTAs activate the spindle assembly checkpoint (SAC), delaying cells in mitosis. SAC prevents metaphase to anaphase transition until all chromosomes are correctly attached to the spindle microtubules and bi-oriented in the metaphase plate. Hence, chronic activation of SAC induced by MTAs is expected to lead to cell death. However, resistance to MTAs, namely due to their effect on microtubules, limit their efficacy, allowing cells to escape cell death through premature mitotic exit, or slippage. Therefore, alternative antimitotics that do not interfere with microtubules have been investigated. Regulators of the SAC emerged as attractive targets, either individually or in combination with other drugs. Indeed, combination therapy has been used as a method to overcome drug resistance. In this thesis, targeting of the SAC silencer p31comet was investigated as a strategy to potentiate the efficacy of anticancer drugs. First, p31comet knockdown was assessed in combination with the MTA paclitaxel or with the pro-apoptotic Navitoclax, using cell non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Knockdown of p31comet enhanced paclitaxel and Navitoclax cytotoxicity through distinct mechanistic. p31comet knockdown increased mitotic block duration in cells challenged with nanomolar concentrations of paclitaxel, leading to an additive effect in terms of cell death which was predominantly anticipated during the first mitosis. On the other hand, when p31comet‑depleted mitotic‑arrested cells were challenged with the apoptosis potentiator Navitoclax, cell fate was shifted to accelerated post‑mitotic death. The efficacy of this strategy was further validated in 3D monotypic spheroids. Notably, p31comet knockdown enhanced the cytotoxicity of clinically relevant doses of paclitaxel and Navitoclax in NSCLC spheroids. Secondly, the clinical relevance of p31comet was investigated in oral cancer. p31comet expression was first screened across omics data on head and neck squamous carcinoma (HNSCC), and associated with other genes and relevant signaling pathways, as well as with clinicopathological features. p31comet was overexpressed in HNSCC samples compared to normal tissues. Moreover, p31comet overexpression coincided with changes in pathways that are frequently dysregulated in cancer, and with altered-chromatin status, highlighting its clinical relevance in oral cancer. p31comet was also positively correlated with its interactors Mad2 and TRIP13. However, the isolated impact of p31comet expression on the survival of HNSCC patients was not conclusive. Remarkably, p31comet knockdown potentiated the cytotoxicity of cisplatin in OSCC cells that displayed more resistance to cisplatin. In conclusion, p31comet inhibition is a promising strategy to enhance the lethality of antimicrotubule drugs and apoptosis‑inducing small molecules in NSCLC, with distinct mechanisms. Moreover, p31comet is a potential target with clinical relevance in oral cancer, and the combination of p31comet inhibition with cisplatin deserves to be explored for oral cancer in the context of cisplatin resistance. Overall, this work reinforces the significance of SAC targeting in cancer treatment.