Development and evaluation of berberine nanoparticles as an antimicrobial tool in endodontic irrigation.

Abstract

A terapia endodôntica pretende promover a desinfeção do sistema de canais, diminuindo a carga microbiológica, ajudando o organismo a combater a inflamação e infeção, bem como a recuperação dos tecidos danificados. A irrigação tem o papel central na terapia endodôntica pela atividade antimicrobiana dos agentes irrigantes. No entanto, existem desvantagens associadas às soluções irrigantes utilizadas atualmente, que podem causar riscos aos pacientes, e que urge resolver. Os compostos naturais têm atraído a atenção devido às suas potenciais atividades biológicas, à sua fácil acessibilidade e ao facto de serem promissores para combater os mecanismos de resistência dos agentes patogénicos. A terapia fotodinâmica (PDT), é uma estratégia de tratamento não invasiva emergente que pode ser utilizada na terapia de várias doenças, nomeadamente em infeções microbianas. Por sua vez, a nanomedicina surgiu como uma ferramenta para melhorar a eficiência terapêutica de compostos bioativos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma solução irrigante recorrendo a um composto natural (berberina, BBR) e a um sistema de entrega (nanopartículas poliméricas) para aplicação numa PDT. A BBR apresenta diversas características promissoras para esta dupla aplicação pois tem atividade antimicrobiana, e propriedades de agente fotosensibilizador. Após incorporação da BBR em nanopartículas, procedeu-se à sua caracterização físico-química e biológica. A capacidade de atuar sob agentes patogénicos presentes nos canais infectados foi avaliada utilizando Enterococcus faecallis e Candida albicans, na ausência e na presença da PDT. As nanopartículas contendo BBR foram obtidas por nanoprecipitação, utilizando o polímero ácido poli-lático-co-glicólico (PLGA) e o surfactante álcool poli-vinílico. A caraterização físico-química revelou nanopartículas com cerca de 140 nm e -4 mV de carga superficial, que não foram afetadas pela presença de BBR, incorporada com uma eficiência de 67%. As nanopartículas contendo BBR mostraram-se estáveis após 20 semanas de armazenamento a 4º e a 25ºC. A atividade antioxidante da BBR foi mantida com a incorporação nas nanopartículas, embora com uma diminuição da sua eficácia. Recorrendo a fibroblastos gengivais humanos avaliou-se a sua atividade metabólica na presença da BBR livre, incorporada nas nanopartículas e das nanopartículas sem BBR, que se veio a verificar inexistente. A atividade antimicrobiana foi avaliada em Enterococcus faecalis e Candida albicans. A BBR livre reduziu o crescimento planctónico a ≥ 125 μg/mL. Após a incorporação em nanopartículas 20 μg/mL em BBR levaram a uma redução significativa, após 1 hora de contacto, na população planctónica e séssil. A 30 μg/mL, as nanopartículas contendo BBR reduziram a viabilidade das bactérias endodônticas sésseis, após 24 horas de exposição. A atividade das nanopartículas vazias foi pouco expressiva, no crescimento planctónico, ao contrário da população séssil. Para validar o irrigante desenvolvido, utilizaram-se fragmentos de dentes inoculados com Enterococcus faecallis. Em substrato dentário, a aplicação das nanopartículas contendo BBR em associação com PDT, demonstrou eficácia antimicrobiana superior. As nanopartículas desenvolvidas contendo BBR, para além de demonstrarem atividade antibacteriana potenciaram os efeitos da BBR livre e após a aplicação da PDT permitiu a eliminação de bactérias no sistema canalar. A associação, nanopartículas contendo BBR com PDT apresenta potencial como uma abordagem promissora na terapia endodôntica.

Endodontic therapy aims to promote the disinfection of the canal system, reducing the microbiological load, helping the body to fight inflammation and infection, as well as the recovery of damaged tissues. Irrigation plays a central role in endodontic therapy due to the antimicrobial activity of irrigating agents. However, there are disadvantages associated with the irrigating solutions currently used, which can cause risks to patients, and which need to be resolved. Natural compounds have attracted attention due to their potential biological activities, their easy accessibility and the fact that they are promising for combating the resistance mechanisms of pathogens. Photodynamic therapy (PDT) is an emerging non-invasive treatment strategy that can be used to treat various diseases, particularly microbial infections. In turn, nanomedicine has emerged as a tool to improve the therapeutic efficiency of bioactive compounds. The aim of this study was therefore to develop an irrigating solution using a natural compound (berberine, BBR) and a delivery system (polymeric nanoparticles) for application in PDT. BBR has several promising characteristics for this dual application as it has antimicrobial activity and photosensitising agent properties. After incorporating BBR into nanoparticles, its physicochemical and biological characterisation was carried out. The ability to act on pathogens present in infected canals was assessed using Enterococcus faecallis and Candida albicans, in the absence and presence of PDT. The nanoparticles containing BBR were obtained by nanoprecipitation using the polymer poly-l-lactic-co-glycolic acid (PLGA) and the surfactant polyvinyl alcohol. Physico-chemical characterisation revealed nanoparticles of around 140 nm and -4 mV surface charge, which were unaffected by the presence of BBR, incorporated with an efficiency of 67%. The nanoparticles containing BBR were stable after 20 weeks of storage at 4º and 25ºC. The antioxidant activity of BBR was maintained with its incorporation into the nanoparticles, although its effectiveness decreased. Using human gingival fibroblasts, their metabolic activity was assessed in the presence of free BBR incorporated into the nanoparticles and nanoparticles without BBR, which turned out to be non-existent. The antimicrobial activity was evaluated on Enterococcus faecalis and Candida albicans. Free BBR reduced planktonic growth to ≥ 125 μg/mL. After incorporation into nanoparticles, 20 μg/mL in BBR led to a significant reduction, after 1 hour of contact, in the planktonic and sessile population. At 30 μg/mL, nanoparticles containing BBR reduced the viability of sessile endodontic bacteria after 24 hours of exposure. The activity of the empty nanoparticles was negligible in terms of planktonic growth, unlike the sessile population. To validate the irrigant developed, fragments of teeth inoculated with Enterococcus faecallis were used. In dental substrates, the application of nanoparticles containing BBR in association with PDT showed superior antimicrobial efficacy. The nanoparticles developed containing BBR, in addition to demonstrating antibacterial activity, potentiated the effects of free BBR and after the application of PDT allowed the elimination of bacteria in the canal system. The association of nanoparticles containing BBR with PDT shows potential as a promising approach to endodontic therapy.