Study of leukocyte - platelet rich fibrin (L-PRF) effect in human peripheral blood and its antimicrobial action. A Study by flow cytometry and microbiological culture.

Abstract

A fibrina rica em plaquetas e leucócitos (L-PRF) é um concentrado plaquetário que auxilia nos processos de regeneração e cicatrização. Estudos anteriores demonstraram que o L-PRF pode influenciar positivamente a resposta imunitária e possui propriedades antibacterianas, sugerindo o seu potencial para o tratamento de feridas e regeneração tecidular. No entanto, a compreensão detalhada dos mecanismos subjacentes às suas propriedades imunológicas e antibacterianas permanece limitada, especialmente no que diz respeito às interações específicas dos componentes individuais do L-PRF com as células imunitárias e à sua eficácia antimicrobiana contra diferentes patógenos. Realizámos um estudo in vitro utilizando componentes de L-PRF (membrana e exsudado) para analisar os seus efeitos na ativação plaquetária em sangue total, nas interações plaqueta-leucócito, na secreção de citocinas e na atividade antimicrobiana. O exsudado de L-PRF foi utilizado para a análise in vitro de biomarcadores moleculares em sangue total autólogo por citometria de fluxo. A membrana e o exsudado de L-PRF foram utilizados em testes de suscetibilidade pelo método Kirby-Bauer de difusão em ágar para avaliar a sua atividade antimicrobiana. O nosso desenho experimental permitiu a avaliação de biomarcadores moleculares de ativação plaquetária, da presença de leucócitos e das interações plaqueta-leucócito. A expressão de GPIIbIIIa ativada e P-selectina aumentou significativamente (p<0,001) quando o exsudado de L-PRF foi adicionado às plaquetas de sangue total. Em relação à mobilização intracelular de Ca2+, o exsudado de L-PRF induziu respostas significativas (p<0,001). Verificamos que o exsudado de L-PRF continha diferentes populações de leucócitos, sendo as células T CD4+ as mais representativas das células T. Foi possível estabelecer um perfil de citocinas no exsudado de L-PRF, com a IL-8 humana exibindo a média mais alta (16,90 pg/mL). A atividade antimicrobiana das membranas de L-PRF foi avaliada contra Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Candida albicans (ATCC 90028). Este estudo revelou uma heterogeneidade significativa na suscetibilidade ao L-PRF. Todas as amostras de membrana de L-PRF exibiram atividade antimicrobiana contra P. aeruginosa, com uma zona de inibição média de 13 mm ± 3,85 DP. E. faecalis apresentou um diâmetro de inibição médio de 7,25 mm ± 5,15 DP. A suscetibilidade de C. albicans ao L-PRF variou entre as amostras, com resultados tanto inibitórios como não inibitórios. O nosso estudo contribuiu significativamente para a compreensão dos efeitos do L-PRF, fornecendo novas evidências sobre a ativação plaquetária e as interações plaquetas-leucócitos mediadas pelo exsudado de L-PRF. Destacámos também o perfil de citocinas presente no exsudado de L-PRF, que mostra o seu papel importante na resposta inflamatória e cicatrização de feridas. Em termos de atividade antimicrobiana, as nossas descobertas revelaram variabilidade na suscetibilidade ao L-PRF, mas, destacando a sua ação inibitória frente a P. aeruginosa e sublinhando a importância de caracterizar e padronizar os componentes do L-PRF para otimizar o seu uso clínico.

Leukocyte and platelet rich fibrin (L-PRF) is a platelet concentrate that aid in regeneration and healing processes. Previous studies have demonstrated that L-PRF can positively influence the immune response and has antibacterial properties, suggesting its potential for wound treatment and tissue regeneration. However, a detailed understanding of the mechanisms underlying its immunological and antibacterial properties remains limited, particularly concerning the specific interactions of the individual components of L-PRF with immune cells and its antimicrobial efficacy against different pathogens. We conducted an in vitro study using L-PRF components (membrane and exudate) to analyze their effects on platelet activation in whole blood, platelet-leukocyte interactions, cytokine secretion, and antimicrobial activity. The L-PRF exudate was used for the in vitro analysis of molecular biomarkers in autologous whole blood by flow cytometry. The L-PRF membrane and exudate were used in susceptibility tests using the Kirby-Bauer agar diffusion method to evaluate its antimicrobial activity. Our experimental design allowed for the evaluation of molecular biomarkers of platelet activation, the presence of leukocyte populations, and platelet-leukocyte interactions. The expression of activated GPIIbIIIa and P-selectin significantly increased (p<0.001) when L-PRF exudate was added to whole blood platelets. Regarding intracellular Ca2+ mobilization, L-PRF exudate induced significant responses (p<0.001). We verified that the L-PRF exudate contained different populations of leukocytes, with CD4+ T cells being the most representative of T cells. It was possible to establish a cytokine profile in the L-PRF exudate, with human IL-8 exhibiting the highest average (16.90 pg/mL). The antimicrobial activity of the L-PRF membranes was evaluated against Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), and Candida albicans (ATCC 90028). This study revealed significant heterogeneity in susceptibility to L-PRF. All L-PRF membrane samples exhibited antimicrobial activity against P. aeruginosa, with a mean inhibition zone of 13 mm ± 3.85 SD. E. faecalis showed a mean inhibition diameter of 7.25 mm ± 5.15 SD. The susceptibility of C. albicans to L-PRF varied between the samples, with both inhibitory and non-inhibitory results. Our study significantly contributed to the understanding of the effects of L-PRF, providing new evidence on platelet activation and platelet-leukocyte interactions mediated by L-PRF exudate. We also highlighted the cytokine profile present in the L-PRF exudate, that shows its important role in the inflammatory response and wound healing. In terms of antimicrobial activity, our findings revealed variability in susceptibility to L-PRF but pointing out its inhibitory effect against P aeruginosa and, underscoring the importance of characterizing and standardizing L-PRF components to optimize its clinical use.