Malignant ascites microenvironment kinetics during ovarian cancer metastization: comprehension of therapeutic resistances

Abstract

O cancro de ovário (CO) é uma das principais causas de morte entre mulheres, na maioria dos países desenvolvidos. Este tipo de cancro é caracterizado por um crescimento rápido e disseminação intraperitoneal, o que leva á acumulação de líquido ascítico maligno (LAM). O LAM é frequentemente encontrado em pacientes com carcinoma seroso de alto grau, especialmente em estágios avançados, e representa um microambiente tumoral único, composto por uma mistura complexa de componentes celulares e acelulares – como fatores de crescimento, citocinas e lípidos – que favorecem um microambiente pró-inflamatório e promotor do tumor, associado a um mau prognóstico. Por ser uma amostra líquida valiosa, o LAM representa uma fonte exclusiva para a investigação da progressão tumoral. Ao longo dos anos, o interesse em caracterizar os seus componentes e o seu papel na progressão do CO tem crescido significativamente.

O CO recorrente é frequentemente acompanhado pela acumulação de LAM, que está associado à quimiorresistência e mau prognóstico. Apesar do tratamento padrão com carboplatina e paclitaxel, muitos pacientes têm recidivas devido à quimiorresistência. Melhorias nos resultados do CO têm sido relacionadas ao aumento da infiltração de células T CD8+, embora a sua presença não assegure uma resposta imunológica antitumoral efetiva. A exposição prolongada a antigénios, células imunes supressoras ou estímulos inflamatórios leva á exaustão das células T. As células T exaustas apresentam funcionalidade reduzida, perdendo a capacidade de secretar interleucina (IL)-2, fator de necrose tumoral (TNF)α e interferão (IFN)γ. Estas células apresentam alterações fenotípicas, como a expressão de recetores co-inibitórios, como proteína 3 do domínio mucínico (TIM-3), proteína 1 de morte celular programada (PD-1) e proteína 3 de ativação de linfócitos (LAG-3). As células tumorais e células imunes supressoras expressam os ligandos destes recetores, prejudicando ainda mais as respostas das células T e facilitando a progressão tumoral.

Este projeto teve como objetivo identificar novos biomarcadores no sobrenadante do LAM de pacientes com CO por meio de uma abordagem proteómica. A análise revelou que o LAM do CO favorece um ambiente proliferativo, promovendo o crescimento tumoral ao estimular as células tumorais a usar vias metabólicas alternativas, como a

via do colesterol. Além disso, o LAM de pacientes tratados mostrou um ambiente imunossupressor, caracterizado pelo aumento de expressão de proteínas da via de sinalização de IL-4 e IL-13 e pela redução da expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC)-II. Uma descoberta notável, foi a identificação da proteína transmembranar 132A, que justifica uma exploração mais aprofundada em coortes maiores de pacientes de CO. A análise proteómica revelou diferenças significativas nas vias que envolvem ácidos gordos, colesterol, glicose e insulina, destacando a sua importância no crescimento tumoral, quimiorresistência e evasão imunológica. Compreender e investigar as principais vias deste microambiente tumoral líquido é fundamental para desenvolver tratamentos mais eficazes. Neste estudo, a via de sinalização do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) surgiu como um alvo terapêutico promissor. O uso do Linsitinib, um inibidor do recetor de IGF-I (IGF-IR), demonstrou bastante potencial em inibir esta via de sinalização. A combinação de Linsitinib e metformina foi avaliada quanto ao efeito anticancerígeno em células OVCAR3, demonstrando uma inibição significativa da proliferação celular por meio da supressão da via de sinalização do IGF-I.

Em resumo, esta tese destaca o papel do LAM como um microambiente tumoral líquido que impulsiona o desenvolvimento e a progressão do CO. O perfil proteico do LAM proporciona conhecimentos valiosos sobre a dinâmica metabólica das células cancerígenas, apontando alvos promissores para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. Além disso, a caracterização dos marcadores de exaustão das células T (TIM-3, PD-1 e LAG-3) no LAM pode servir como um perfil imunológico preditivo para a resposta à imunoterapia. É importante ressaltar que este estudo demonstrou que a exaustão das células T pode ser revertido com o uso de imunoterapias, como o anti-PD-1, reforçando ainda mais o seu potencial em melhorar os resultados para pacientes com CO.

Ovarian cancer (OC) is a leading cause of death among women in most developed countries. This malignancy is characterized by rapid growth and intraperitoneal spread, leading to an accumulation of malignant ascitic fluid (MAF). MAF is commonly found in patients with high-grade serous carcinoma (HGSC), particularly in advanced stages, and represents a unique tumor microenvironment disposed of a complex mixture of cellular and acellular components – such as growth factors, cytokines, and lipids - MAF fosters a pro-inflammatory and tumor-promoting microenvironment associated with poor prognosis. As a valuable liquid sample, MAF offers a unique source for studying tumor progression. Over the years, interest in characterizing its components and their roles in OC progression has grown significantly.

Recurrent OC is often accompanied by MAF accumulation, which is associated with chemoresistance and poor prognosis. Despite the standard treatment with carboplatin and paclitaxel, many patients relapse due to chemoresistance. Improved outcomes in OC have been associated with increased infiltration of CD8+ T cells, although their presence does not guarantee an active anti-tumor immune response. Prolonged exposure to antigens, suppressive immune cells, or inflammatory stimulus drive T cell exhaustion. Exhausted T cells exhibit reduced functionality, losing their ability to secrete interleukin (IL)-2, tumor necrosis factor (TNF)α, and interferon (IFN)γ. These cells are marked by phenotypic changes, including the expression of co-inhibitory receptors, such as mucin domain-containing protein 3 (TIM-3), programmed cell death protein 1 (PD-1) and lymphocyte activation gene 3 protein (LAG-3). Tumor cells and suppressive immune cells express ligands for those receptors, further impairing T-cell responses and facilitating tumor progression.

This project aimed to identify novel biomarkers in the MAF supernatant of OC patients through a proteomics approach. Analysis revealed that OC MAF fosters a proliferative environment, promoting tumor growth by shifting metabolic pathways, including the cholesterol pathway. Additionally, OC MAF from treated patients showed an immunosuppressive environment, characterized by upregulation of IL-4 and IL-13 signaling and downregulation of major histocompatibility complex (MHC)-II. One notable finding was the identification of Transmembrane Protein 132A, which warrants further exploration in larger patient cohorts. Proteomic analysis revealed significant

differences in pathways involving fatty acids, cholesterol, glucose, and insulin, highlighting their roles in tumor growth, chemoresistance, and immune evasion. Targeting key pathways in this liquid tumor microenvironment is crucial for discovering more efficient treatment options. In this study, the insulin-like growth factor I (IGF-I) signaling pathway emerged as a promising therapeutic target. The use of Linsitinib, an IGF-1 receptor (IGF-1R) inhibitor, demonstrated potential in inhibiting this pathway. The combination of linsitinib and metformin was investigated for its anti-cancer effects on OVCAR3 cells, revealing significant inhibition of OC proliferation through suppression of IGF-I signaling.

In summary, this thesis highlights the role of MAF as a liquid tumor microenvironment that drives OC development and progression. The proteomic profile of MAF offers unique insights into the metabolic dynamics of cancer cells and highlights potential targets for more effective therapeutic strategies. Additionally, the characterization of T-cell exhaustion markers (TIM-3, PD-1 and LAG-3) in MAF could serve as a predictive immune profile for immunotherapy response. Importantly, this study demonstrated that T-cell exhaustion can be reversed using immunotherapies such as anti-PD-1, further supporting their potential in improving outcomes for OC patients.