Co-targeting of cancer glycolytic metabolism and angiogenesis through polymeric nanoparticles for glioblastoma therapy.

Abstract

O glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral primário letal, com sobrevivência mediana de apenas 15-18 meses, mesmo após ressecção cirúrgica máxima, radioterapia e quimioterapia com temozolomida. A eficácia terapêutica permanece limitada por mecanismos de resistência e pela baixa penetração de fármacos através da barreira hematoencefálica. Nanosistemas multifuncionais surgem como soluções promissoras para ultrapassar estes desafios. Permitem a entrega de fármacos em combinações sinérgicas, ajustes na biodistribuição, com maior acumulação tumoral, e proteção de degradação enzimática. Isto é especialmente importante para ácidos nucleicos e macromoléculas, cuja eficácia anti-GBM se perde frequentemente na translação pré-clínica-clínica devido à rápida degradação ou baixa permeabilidade cerebral. Desde 2009, o bevacizumab é aprovado pela FDA como terapia anti-angiogénica para GBM recorrente. Contudo, o efeito terapêutico é limitado pela baixa penetração cerebral e por adaptações metabólicas tumorais, nomeadamente intensificação da glicólise em zonas de fraca perfusão. Neste contexto, esta tese apresenta o desenvolvimento e validação pré-clínica das BDNP: nanopartículas para co-entrega de bevacizumab e dicloroacetato, inibidor da glicólise, por via intranasal. A superfície das BDNP foi funcionalizada com o péptido AP-9, que se liga à CD147, para aumentar a retenção das nanopartículas no tecido tumoral. As BDNP apresentaram características físicas uniformes e reprodutíveis, ~200 nm, carga neutra, com retenção eficiente de bevacizumab, ~60%, e dicloroacetato, ~40%. À semelhança do bevacizumab livre, as BDNP inibiram eficazmente a tubulogénese endotelial induzida por linhas celulares de GBM e neuroesferas derivadas de pacientes, além de reduzir a vascularização da membrana corioalantóica de embriões de galinha. Adicionalmente, as BDNP preveniram a hiperglicólise induzida por bevacizumab, mantendo taxas de consumo de oxigénio e de acidificação extracelular comparáveis às de células não tratadas. In vitro, a funcionalização com AP-9 aumentou a retenção das nanopartículas em células tumorais, embora in vivo não tenha melhorado significativamente a acumulação tumoral ou eficácia terapêutica. Após administração intranasal em ratinhos com tumores U-251MG, as BDNP acumularam-se rapidamente no cérebro e no tecido peri-tumoral. Tratamentos intranasais semanais aumentaram significativamente a sobrevivência dos animais, sem toxicidade sistémica detetável. Um comportamento semelhante foi observado num modelo de GBM em ratinho estabelecido com neuroesferas derivadas de pacientes. Além de apresentar o desenvolvimento das BDNP e resultados da validação pré-clínica, esta tese discute os desafios enfrentados, bem como as suas limitações. Destaca-se a necessidade de testar o sistema em modelos ortotópicos imunocompetentes e avaliar o perfil farmacocinético. Compara-se as BDNP com sistemas similares e propõem-se estratégias para aumentar o potencial de translação clínica.

Glioblastoma (GBM) is a lethal primary brain tumor with a median survival of only 15-18 months despite maximum surgical resection, radiotherapy and temozolomide-based chemotherapy. Therapeutic efficacy remains limited by resistance mechanisms and poor drug penetration across the blood-brain barrier. Multidrug nanosystems have emerged as a promising strategy to overcome these barriers, enabling synergistic drug delivery, improved biodistribution, enhanced tumor accumulation, and protection against enzymatic degradation. Such abilities are particularly important for nucleic acids and macromolecules, whose anti-GBM efficacy is often lost in preclinical-to-clinical translation by rapid degradation or brain impermeability. Since 2009, bevacizumab has been FDA-approved as an anti-angiogenic therapy for recurrent GBM. However, its therapeutic benefit is hindered by limited brain penetration and tumor metabolic adaptation, notably glycolysis upregulation in poorly perfused regions. To address these challenges, this thesis reports the development and preclinical evaluation of BDNP, a novel nanoparticle system co-delivering bevacizumab and the glycolysis inhibitor dichloroacetate via intranasal administration. BDNP surface was functionalized with AP-9, a CD147-targeting peptide, to improve nanosystem retention in tumor tissue. BDNP exhibited uniform and reproducible physical characteristics, ~200 nm diameter, neutral charge, with efficient entrapment of bevacizumab, ~60%, and dichloroacetate, ~40%. In vitro studies, using GBM cell lines and patient-derived neurospheres, confirmed BDNP’s ability to inhibit endothelial tubulogenesis similarly to free bevacizumab and reduce vascularization in the chick chorioallantoic membrane model. BDNP also attenuated bevacizumab-induced metabolic shifts, preserving oxygen consumption and extracellular acidification rates comparable to bevacizumab-naïve cells. Surface functionalization with AP-9 enhanced nanoparticle uptake in CD147-expressing tumor cells in vitro, although it did not significantly improve tumor accumulation or therapeutic outcomes in vivo. Following intranasal delivery in U-251MG tumor-bearing mice, BDNP accumulated in the brain and peri-tumoral regions. Weekly treatment improved survival without systemic toxicity. A similar benefit was observed in mice bearing patient-derived neurospheres. In addition to presenting BDNP's formulation and promising preclinical outcomes, in this thesis, we provided an honest appraisal of the challenges faced during nanoparticle design and validation, as well as its limitations. The need to test the system in immunocompetent orthotopic GBM models and to evaluate pharmacokinetics are highlighted. Comparisons with similar platforms and proposals for enhancing clinical translation potential are also provided.