Understanding the mechanisms of protein intestinal permeation by using enterocyte-based in vitro co-culture cells

Abstract

Despite the continuous advances in pharmaceutical industry, oral administration of drugs is still a huge challenge because of the harsh features of the gastrointestinal tract. Suitable methods, introduced in an early stage of drug design and development, that allow foresee the absorption mechanisms of those drugs are essential to improve the drug delivery field. Caco-2 based models have been the gold standard in vitro method used for such purposes, although they are far from being a perfect model because lack many important players that interfere in drug absorption mechanism.

In the herein work, a triple co-culture comprising Caco-2, HT29-MTX and Raji B cells was established. This model mimics in a more closely way the human intestinal epithelium presenting the main intervenients in the process of drug absorption, being, thus, an asset to new orally administrated drugs development.

The model contains the Caco-2 and HT29-MTX cells in physiological proportions, acceded by flow cytometry. The Caco-2 cells resemble enterocytes when in culture and, in order to make their distinction from the HT29-MTX cells, this cell line was transfected with a vector that contains the gene for the expression of the enhanced green fluorescence protein (EGFP). In turn, the mucus producer HT29-MTX cells look alike goblet cells; it was shown that the production of mucus by HT29-MTX cells was not influenced by the growth of these cells together with Caco-2 and Raji B cells. Furthermore, Raji B cells were also able to induce M-cell phenotype on enterocytes even with the presence of HT29-MTX cells. This induction was observed through an actin labeling, as enterocytes lost their microvilli and the re-organization of the cytoskeleton was observed.

Another advantage of the established model is that the monolayer tightness is more similar to the physiological than the Caco-2 model due to the presence of more than one cell type that forms junctions with different strength between them.

To test and validate the model, permeability experiments with insulin were made in order to known its absorption mechanism through a microscopic analysis, either paracellular or transcellular, whether this mechanism is the same as in the other models and compare the amount of insulin that it is absorbed by each of these by ELISA. As expected, in all the models tested the main mechanism through which insulin was absorbed was the paracellular pathway. Moreover, despite there were no statistically significant differences, the model that had higher permeability was the Caco-2:HT29-MTX co-culture. It can be explained by the fact that M-cells may do not be a preponderant intervenient in insulin absorption since they are specialized to uptake micro and nanoparticles through the transcellular mechanism.

Thus, it is still necessary test several other compounds with different characters and compare those results with the in vivo but it is expected that the triple co-culture model is a good alternative to the in vitro methods already existent. -------------------------------------------------------------------------------------- Apesar dos avanços contínuos na indústria farmacêutica, a administração oral de fármacos é ainda um enorme desafio devido às características adversas do tracto gastrointestinal. Assim, a introdução de métodos de diagnóstico adequados numa fase inicial de desenvolvimento e conceção de fármacos permitem prever os mecanismos de absorção dos mesmos sendo por isso essenciais para o melhoramento desta área de investigação.

Modelos in vitro baseados em culturas celulares com células Caco-2 tem sido o método gold standard para esse fim, no entanto, uma vez que é um modelo relativamente simples em que alguns dos principais fatores que contribuem para a absorção de fármacos estão em falta, este está longe de ser um modelo perfeito.

No presente trabalho foi estabelecida uma tripla co-cultura composta por células Caco-2, HT29-MTX e Raji B. Este modelo mimetiza de melhor forma o epitélio intestinal humano apresentando os principais intervenientes no processo de absorção de fármacos, sendo uma mais-valia para o desenvolvimento de novos fármacos para administração por via oral.

Este modelo é constituído por células Caco-2 e HT29-MTX numa proporção semelhante à fisiológica observada através de ensaios de citometria de fluxo. As células Caco-2 assemelham-se a enterócitos quando estão em cultura e, com o propósito de ser feita a sua distinção das células HT29-MTX para que a proporção entre elas pudesse ser analisada, a linha celular foi transfetada com um vetor que contém a sequência de um gene que codifica para a expressão da proteína enhanced green fluorescence protein (EGFP). Por sua vez, as células produtoras de muco HT29-MTX assemelham-se às células caliciformes e conseguem produzir o muco mesmo quando crescem em conjunto com as células Caco-2 e Raji B. As células Raji B, caracterizadas pela indução da mudança do fenótipo dos enterócitos em células M, também demonstraram que a presença das células HT29-MTX não interfere com essa função. Esta alteração do fenótipo foi feita através da marcação da actina uma vez que os enterócitos perdem as suas microvilosidade havendo por isso um rearranjo do seu citoesqueleto.

Uma outra vantagem do modelo estabelecido é que a tensão da monocamada é mais semelhante à fisiológica comparativamente com os outros modelos; isto deve-se à presença de mais de um tipo celular que formas junções entre si com diferentes graus de tensão.

Para testar e validar o modelo, experiências de permeabilidade da insulina foram feitas, não só para saber qual o mecanismo pelo qual é absorvida através de análise microscópica, se paracelular ou trascelularmente, mas também se esse mecanismo se mantém em todos os modelos e comparar as quantidade de insulina que atravessa cada um deles com testes ELISA.

Como esperado, os ensaios revelaram que em todos os modelos a insulina é absorvida através de um mecanismo paracelular. Para além disso, apesar de não terem tido significância estatística, o modelo cuja permeabilidade foi superior foi a co-cultura Caco-2:HT29-MTX. Isto pode ser explicado pelo facto de as células M não terem um papel preponderante na absorção da insulina uma vez que são células especializadas na internalização de microrganismos e nanoparticulas.

Assim, é ainda necessário testar vários outros compostos com caracteres diferentes e comparar os seus resultados com os de in vivo mas é expectável que o modelo da cultura tripla seja uma boa alternativa para os métodos in vitro já existentes.